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上海信帆生物代理銷售明膠酶譜法試劑盒,現(xiàn)貨供應(yīng),歡迎?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMP2/9)操作簡(jiǎn)單,*,靈敏度高歡迎。本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測(cè) MMP-2、MMP-9 活性。咨詢!
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明膠酶譜法試劑盒
描述:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組 織重塑等過(guò)程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的 MMP-2、MMP-9 參與各種生理與病理過(guò)程,其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視 1。
本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測(cè) MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,其靈敏度可達(dá) 1 nM,高于 ELISA 方法 2,其 基 本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳, 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,形 成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域,從而能同時(shí)指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供
MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測(cè)少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性,檢 測(cè)靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),如果小膠加樣孔為 10~15個(gè),則總計(jì)可檢測(cè) 500~750 個(gè)樣品。
明膠酶譜法試劑盒
適用: 檢測(cè) MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。 組成與儲(chǔ)存 (50 assays):
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, ?20 ºC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ºC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋;
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋;
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 ºC。
檢測(cè)步驟:
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠:推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化,并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,混勻后加入過(guò)硫酸銨和 TEMED,等待凝膠聚合。
2. 待測(cè)樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染 Marker 即可。陽(yáng) 性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合,取 5-15µl 上樣。
3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為 20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入 10 ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時(shí)。陽(yáng)性 對(duì) 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時(shí)即可顯示。如 MMP 活性低,應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為 10 小時(shí)或 過(guò)一夜。
6. 顯色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見(jiàn) SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽(yáng) 性對(duì)照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶。
7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑 色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。
說(shuō)明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,作為記錄保留。
參考文獻(xiàn):
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102, 196–202
SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書
常規(guī)考馬斯亮藍(lán) SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝 膠,并緩慢搖動(dòng) 2h;
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng) 2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的 藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過(guò)程需要 2~4h,也可脫色過(guò)一夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈 的背景);
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在 7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對(duì) 凝膠進(jìn)行處理后保存。
安全性:含有甲醇,無(wú)特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。
說(shuō)明:
1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍(lán) R250 420ml 甲醇 100ml 冰乙酸,定容至 1000ml,混合 1h 后用 Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾,于室溫可無(wú)限期保存;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或 4 ºC 保存,可反復(fù)使用 2-4 次。
明膠酶譜法試劑盒
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