小鼠皮質醇（Cortisol）ELISA檢測試劑盒的正確使用方法

信帆生物供應各類ELISA試劑盒，提供免費代測服務，產品質量穩(wěn)定，庫存充足。

【檢驗原理】

試劑盒采用酶聯(lián)免疫分析方法。采用生物素標記Cortisol，純化的抗Cortisol抗體包被微孔板，在競爭抑制反應中，一定量的固相抗體與生物素標記Cortisol及非標記抗原（校準品或標本）進行抑制競爭反應，抗體與生物素標記的Cortisol結合量受非標記抗原量所抑制，非標記抗原量多,抗體與生物素標記的Cortisol結合就少，反之結合就多；反應平衡后，形成固相抗體-生物素化Cortisol，再加入酶標記的親和素，形成固相抗體-生物素化Cortisol-酶標-親合素復合物。經(jīng)加底物顯色后，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）。隨著Cortisol濃度的升高，OD值逐漸下降呈良好的線性關系。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、重復性好、操作簡單、快速等特點，對血清中Cortisol的減少或升高有可靠的檢出性能。

【主要組成成分】

主要成分

標準品濃度依次為：12、6、3、1.5、0.75、0 ng/mL本品必須按照具有潛在的感染性進行處理，處理過程應當遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

 1、酶標儀

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、500ml量筒

7、無粉一次性乳膠手套

【儲存條件及有效期】

 1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

 2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

 3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體，有效期為14天，其他成分在標簽標明的有效期內是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

 半自動的酶標儀，如Thermo MK3，或者國產酶標儀。

【樣本要求】

 樣本類型和采集

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

2、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。

4、組織：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。

樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗方法】

試劑準備

1、使用前，所有的組分都要至少復溫30min，確保充分復溫到室溫。

2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

操作程序

1.      將各種試劑移至室溫平衡兩小時，取濃縮洗滌液，根據(jù)當批檢測數(shù)量，用蒸餾水1：20稀釋，混勻后備用。

2.      將預包被板從密封袋中取出，設一個空白對照孔，不加任何液體；每個校準品設2孔，每孔加入對應校準品50μl；其余每個檢測孔直接加待測血清或質控品50μl。

3.      除空白孔外所有孔加入生物素化抗原50μl，混勻，貼上封板膜，置37℃溫育60分鐘。

4.      手工洗板：棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復3次后拍干。洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

5.      每孔加入酶標親合素50μl（空白對照孔除外），混勻，貼上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

6.      手工洗板：棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復3次后拍干。洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

7.      每孔加顯色劑A 50μl，顯色劑B 50μl，振蕩混勻后，置37℃避光顯色15分鐘，每孔加終止液50μl。

8.      用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白對照孔調零點，然后測定各孔光密度值（OD值）。

【實驗結果計算】

檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

【檢驗方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標示的有效期內使用，過期產品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6、通過其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

【產品性能指標】

1.  外觀和物理檢查:試劑盒應組分齊全，內外包裝均應完整，標簽清晰，液體試劑無滲漏。各組分裝量不少于表1中要求。

2.  線性: 用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），在0.375 ng/mL – 12 ng/mL范圍內，劑量-反應曲線相關系數(shù)（r）的絕對值應不低于0.9900。

3.  精密度

3.1分析內精密度:試劑盒質控品測定結果的變異系數(shù)（CV）應不大于15.0%。

3.2批間精密度:在三個不同批次產品之間，質控品測定結果的變異系數(shù)（CV）應不大于15.0%

4.  低檢出限:低檢測濃度小于0.1 ng/mL。

5.       質控品測定值: 每次檢測結果均應在允許范圍內。

【注意事項】

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后洗手。

技術提示

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

廢物處理

 所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應當遵循傳染性或潛在傳染性產品的處理程序，每個實驗室都有責任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴格依照有關規(guī)定對待所有的廢物和污物。

免責聲明

1.  試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。

小鼠皮質醇（Cortisol）ELISA檢測試劑盒的正確使用方法